熒光分光光度計(jì)是用于掃描液相熒光標(biāo)記物所發(fā)出的熒光光譜的種儀器。其能提供包括激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及熒光強(qiáng)度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數(shù),從各個(gè)角度反映了分子的成鍵和結(jié)構(gòu)情況。通過(guò)對(duì)這些參數(shù)的測(cè)定, 不但可以做般的定量分析,而且還可以推斷分子在各種環(huán)境下的構(gòu)象變化,從而闡明分子結(jié)構(gòu)與能之間的關(guān)系。熒光分光光度計(jì)的激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍般是190~650nm,發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍是200~800nm??捎糜谝后w、固體樣品(如凝膠條)的光譜掃描。
熒光光譜法具有靈敏度、選擇性強(qiáng)、用樣量少、方法簡(jiǎn)便、作曲線線形范圍寬等優(yōu)點(diǎn),可以廣泛應(yīng)用于生命、學(xué)、藥學(xué)和藥理學(xué)、有機(jī)和無(wú)機(jī)化學(xué)等域。
物質(zhì)熒光的產(chǎn)生是由在通常狀況下處于基態(tài)的物質(zhì)分子吸收激發(fā)光后變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài), 這些處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的,在返回基態(tài)的過(guò)程中將分的能量又以光的形式放出,從而產(chǎn)生熒光。
不同物質(zhì)由于分子結(jié)構(gòu)的不同,其激發(fā)態(tài)能的分布具有各自不同的征,這種征反映在熒光上表現(xiàn)為各種物質(zhì)都有其征熒光激發(fā)和發(fā)射光譜;因此可以用熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的不同來(lái)定性地行物質(zhì)的鑒定。
在溶液中,當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度較低時(shí),其熒光強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度通常有良好的正比關(guān)系,即IF=KC,利用這種關(guān)系可以行熒光物質(zhì)的定量分析,與紫外-可見(jiàn)分光光度法類似,熒光分析通常也采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法行。
1. 熒光發(fā)射光譜
選擇某固定波長(zhǎng)的光激發(fā)樣品,記錄樣品中產(chǎn)生的熒光發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長(zhǎng)間的函數(shù)關(guān)系,即得熒光發(fā)射光譜。
2. 熒光激發(fā)光譜
選定某熒光發(fā)射波長(zhǎng)記錄熒光發(fā)射強(qiáng)度作為激發(fā)光波長(zhǎng)的函數(shù),即得熒光激發(fā)光譜。
3.時(shí)間分辨;
可用于對(duì)混合物中光譜重疊但有壽命差異的組分行分辨并分別測(cè)量。
時(shí)間分辨熒光測(cè)定公式如下:
P(t) = P0EXP (-t/τ)
式中P(t):擬合數(shù)函數(shù)
P0:強(qiáng)度取值
EXP:數(shù)運(yùn)算符
t:時(shí)間取值
τ:熒光平均時(shí)間壽命
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