薄層掃描儀是可以對斑點行掃描的用分光光度計,用可見光或紫外光作光源,線性掃描或鋸齒掃描薄層板展開后的斑點,該斑點就吸收該組分征波長的單色光,剩余的單色光經(jīng)透射或反射或發(fā)射熒光,由檢測器積分起來,獲得這塊斑點面積的待測物質(zhì)含量。
原理
薄層色譜又叫薄板層析,是色譜法中的種,是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的種很重要的實驗,屬固—液吸附色譜。它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點,方面適用于少量樣品(幾到幾微克,甚至0.01微克)的分離;另方面在制作薄層板時,把吸附層加厚加大,因此,又可用來制樣品,此法別適用于揮發(fā)性較小或較溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的質(zhì)。此外,薄層色譜法還可用來跟蹤有機反應及行柱色譜之前的種“預試”。
薄層色譜(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示,又稱薄層層析,屬于固-液吸附色譜。是近年來發(fā)展起來的種微量、快速而簡單的色譜法,它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點。方面適用于小量樣品(幾到幾十微克,甚至0.01μg)的分離;另方面若在制作薄層板時,把吸附層加厚,將樣品點成條線,則可分離多達500mg的樣品。因此又可用來制樣品。故此法別適用于揮發(fā)性較小或在較溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。此外,在行化學反應時,常利用薄層色譜觀察原料斑點的逐步消失來判斷反應是否成。
薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板(10×3cm左右)上均勻的涂層吸附劑或支持劑,帶干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細管滴加于離薄層板端約1cm處的起點線上,涼干或吹干后置薄層板于盛有展開劑的展開槽內(nèi),浸入深度為0.5cm。待展開劑前沿離端約1cm附近時,將色譜板取出,干燥后噴以顯色劑,或在紫外燈下顯色。
薄層色譜儀包括:薄層層板點樣器、手動涂布臺、干燥儲備箱、洗板架、紫外光探測器??梢钥焖俜蛛x脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質(zhì)。
類別
1.離心薄層色譜儀 2.棒狀薄層色譜儀 3.手動薄層色譜儀 4.雙波長薄層色譜掃描儀 5.自動薄層色譜儀 6.旋轉(zhuǎn)薄層色譜儀 7.波長薄層色譜儀 8.型薄層色譜儀 9.二管陣列薄層色譜掃描儀 10.加壓薄層色譜儀 11.暗箱式薄層色譜攝影儀
用途
適用于化學、化、藥、臨床、農(nóng)業(yè)、食品、毒理等域內(nèi)的各種化合物的分離、制、定性鑒別、雜質(zhì)檢查和含量測定。
操作方法
(1) 薄層板制備 除另有規(guī)定外,將1份固定相和3份水在研缽中向方向研磨混合,
去除表面的氣泡后,倒入涂布器中,在玻板上平穩(wěn)地移動涂布器行涂布(厚度為0.2~
0.3mm),取下涂好薄層的玻板,置水平臺上于室溫下晾干,后在110℃烘30分鐘,即置
有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度(可通過透射光和反射光檢視)。
(2) 點樣 除另有規(guī)定外,用點樣器點樣于薄層板上,般為圓點,點樣基線距底
邊2.0cm,樣點直徑及點間距離同紙色譜法,點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為
宜。點樣時注意勿損傷薄層表面。
(3) 展開 展開缸如需預用展開劑飽和,可在缸中加入足夠量的展開劑,并在壁
上貼二條與缸樣、寬的濾紙條,端浸入展開劑中,密封缸的蓋,使系統(tǒng)平衡或
按正文規(guī)定操作。
將點好樣品的薄層板放入展開缸的展開劑中,浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5
~1.0cm(切勿將樣點浸入展開劑中),密封缸蓋,待展開至規(guī)定距離(般為10~15cm),
取出薄層板,晾干,按各品種項下的規(guī)定檢測。
(4) 如需用薄層掃描儀對色譜斑點作掃描檢出,或直接在薄層上對色譜斑點作掃描
定量,則可用薄層掃描法。
薄層掃描的方法,除另有規(guī)定外,可根據(jù)各種薄層掃描儀的結(jié)構(gòu)點及使用說明,
結(jié)合具體情況,選擇吸收法或熒光法,用雙波長或單波長掃描。由于影響薄層掃描結(jié)果
的因素很多,故應在保證供試品的斑點在定濃度范圍內(nèi)呈線性的情況下,將供試品與
對照品在同塊薄層上展開后掃描,行并計算定量,以減少誤差。各種供試品,
只有得到分離度和重現(xiàn)性好的薄層色譜,才能獲得滿意的結(jié)果。
洗脫后測定法
薄層經(jīng)展開后用刮刀或捕集器將斑點的吸附劑捕集后,再用適當有機溶劑洗脫,然后用可見、紫外分光光度法、熒光分光光度法測定含量。
但樣品斑點不能噴顯色劑,以免影響不測定,斑點位置的確定方法。
樣品在紫外線下發(fā)射熒光的,可在紫外燈下觀察斑點并用針劃去斑點位置。
用碘蒸汽顯色,在組分處理出棕色斑點(碘吸附后會揮發(fā))。
用標準物對照,將標準點于邊上測顯色時,蓋住樣品,定出斑點位置。
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